Т4 ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними 5'-фосфатом и 3'-гидроксилом на тупом или липком конце двухцепочечной ДНК. Фермент также может катализировать связывание РНК с одноцепочечной ДНК или РНК в двухцепочечных нуклеиновых кислотах. Однако он не может катализировать связывание между одноцепочечными нуклеотидами. ДНК-лигазу Т4 можно использовать для мечения 3'-конца РНК, циклизации олигонуклеотидов РНК и ДНК, клонирования кДНК и других манипуляций с нуклеиновыми кислотами.