Т4 ДНК-полимераза катализирует синтез ДНК в направлении 5´→3´ в присутствии матриц и праймеров. Этот фермент также обладает 3´→5´ экзонуклеазной активностью, которая сильнее, чем ДНК-полимеразы I. В отличие от ДНК-полимеразы I, Т4 не обладает 5´→3´ экзонуклеазной активностью.