Т4 полинуклеотидкиназа может катализировать перенос γ-фосфатной группы АТФ к 5'-гидроксильному концу и 3'-монофосфатному нуклеозиду олигонуклеотидной цепи (двухцепочечной или одноцепочечной ДНК или РНК). Полинуклеотидкиназа Т4 также обладает 3'-фосфатазной активностью, которая гидролизует фосфатные группы на 3'-концах олигонуклеотидов, дезокси-3'-монофосфатных нуклеозидов и дезокси-3'-дифосфатных нуклеозидов.