В присутствии матрицы и праймеров ДНК-полимераза Т4 катализирует синтез ДНК в направлении 5´→3´. Этот фермент также обладает 3´→5´ экзонуклеазной активностью, которая сильнее, чем у ДНК-полимеразы I. В отличие от ДНК-полимеразы I, ДНК-полимераза Т4 не обладает 5´→3´ экзонуклеазной активностью.