Полинуклеотидкиназа Т4 может катализировать перенос γ-фосфатной группы АТФ к 5'-гидроксильному концу и 3'-монофосфатному нуклеозиду олигонуклеотидной цепи (двухцепочечной или одноцепочечной ДНК или РНК). Полинуклеотидкиназа Т4 также обладает 3'-фосфатазной активностью, которая гидролизует 3'-фосфатные группы с 3'-фосфатных концов олигонуклеотидов, дезокси-3'-монофосфатных нуклеозидов и дезокси-3'-дифосфатных нуклеозидов.